طرق عد الجراثيم الفطرية فى معلق الجراثيم

 طرق عد الجراثيم الفطرية فى معلق الجراثيم مقدمة تعتبر الفطريات كائنات حية دقيقة ذات دور حيوي بالغ الأهمية في النظم البيئية المختلفة، بدءًا من تحليل المواد العضوية وصولًا إلى إقامة علاقات تكافلية مع النباتات. وتلعب الجراثيم الفطرية، وهي الوحدات التكاثرية للفطريات، دورًا محوريًا في انتشارها وبقائها. لذا، فإن تقدير عدد الجراثيم الفطرية بدقة يمثل خطوة أساسية في العديد من المجالات العلمية والتطبيقية، بدءًا من البحوث الأساسية في علم الأحياء الدقيقة والفطريات، وصولًا إلى التطبيقات الصناعية والزراعية والطبية. تتعدد الطرق المستخدمة لعد الجراثيم الفطرية، وتتراوح بين الطرق التقليدية والتقنيات الحديثة المتطورة. من بين هذه الطرق، تبرز طريقة العد باستخدام الشريحة الهيموسيتومترية كخيار شائع وفعال، وذلك لما تتميز به من بساطة نسبية، وسرعة في التنفيذ، وإمكانية إجرائها في معظم المختبرات. تتيح هذه الطريقة تقديرًا مباشرًا لتركيز الجراثيم الفطرية في العينة، مما يجعلها أداة قيمة في الدراسات التي تتطلب تحديد كمي دقيق للجراثيم. في هذا الموضوع، سنتناول بالتفصيل طريقة عد الجراثيم الفطرية باستخدام الشريحة الهيموسيتومترية، مع شرح الخطوات العملية، المعادلات الحسابية، وتقديم أمثلة توضيحية لضمان فهم شامل لهذه التقنية الهامة. مقدمة عن الشريحة الهيموسيتومتر Haemocytometer وأهميتها في عد الجراثيم الفطرية الشريحة الهيموسيتومترية، أو غرفة العد الدموية، هي أداة زجاجية دقيقة تستخدم لعد الخلايا في حجم معلوم من السائل تحت المجهر. صُممت في الأصل لعد خلايا الدم، ولكنها أصبحت أداة أساسية لعد مجموعة متنوعة من الخلايا بما في ذلك الجراثيم الفطرية، البكتيريا، الخلايا الحيوانية والنباتية، وغيرها من الجسيمات الدقيقة. Source تعتبر طريقة العد بالشريحة الهيموسيتومتر Haemocytometer مهمة لعدة أسباب في دراسة الفطريات: تقدير تركيز الجراثيم: تحديد عدد الجراثيم الفطرية في وحدة حجم (مثل ملليلتر) ضروري في العديد من التطبيقات البحثية والصناعية. على سبيل المثال، في الزراعة الحيوية، لتحديد كمية اللقاح الفطري المستخدم. وفي البحوث، لدراسة تأثير تركيزات مختلفة من الجراثيم على العمليات الحيوية. مراقبة نمو الفطريات: يمكن استخدام العد بالهيموسيتومتر لمتابعة نمو الفطريات بمرور الوقت عن طريق قياس زيادة عدد الجراثيم أو الخلايا الفطرية. توحيد التجارب: في التجارب العلمية، من الضروري استخدام تراكيز موحدة من الجراثيم أو الخلايا الفطرية بين المعاملات المختلفة لضمان دقة النتائج وقابليتها للمقارنة. المواد والأدوات اللازمة شريحة هيموسيتومترية Haemocytometer: يفضل استخدام نوع Neubauer improved أو نوع مشابه ذو شبكة عد قياسية. غطاء الشريحة (Coverslip): خاص بالهيموسيتومتر، وغالباً ما يكون أسمك قليلاً من الأغطية العادية. مجهر ضوئي: مجهز بعدسات موضوعية مناسبة (عادة 10x و 40x). محلول تعليق الجراثيم الفطرية: العينة المراد عد جراثيمها. مخفف (Diluent) مناسب (اختياري): مثل الماء المقطر المعقم، أو محلول ملحي فسيولوجي، أو محلول يحتوي على مواد حافظة لمنع تكتل الجراثيم (حسب نوع الفطر). ماصة أو محقنة دقيقة: لسحب ونقل عينة الجراثيم. أنبوب اختبار أو وعاء صغير: لتحضير تخفيف العينة إذا لزم الأمر. عداد يدوي (Clicker) أو قلم وورقة: لتسجيل أعداد الجراثيم. مناديل عدسة: لتنظيف الشريحة والغطاء. مكونات الشريحة الهيمسيتومترية سطح العد: يحتوي على شبكتين محفورتين، كل شبكة مقسمة إلى مربعات صغيرة. غرفة العد: يتم تحديد عمقها بواسطة الغطاء الزجاجي وتكون بعمق 0.10.10.1 ملم. خطوات عد الجراثيم الفطرية باستخدام الهيموسيتومتر تحضير عينة الجراثيم: إذا كانت العينة مركزة جداً: قد تحتاج إلى تخفيف العينة لتسهيل العد وتقليل الخطأ. استخدم المخفف المناسب وقم بتسجيل معامل التخفيف. على سبيل المثال، إذا خففت العينة 1:10، فإن معامل التخفيف هو 10. تأكد من تجانس العينة: رج العينة برفق لضمان توزيع الجراثيم بشكل متجانس قبل سحب جزء منها للعد. التكتلات قد تؤدي إلى نتائج غير دقيقة. في بعض الحالات: قد يكون من المفيد إضافة قطرة من صبغة (مثل أزرق التريبان أو أزرق الميثيلين) لتسهيل رؤية الجراثيم وتمييزها عن الحطام الخلوي أو الشوائب الأخرى. هذا اختياري ويعتمد على طبيعة العينة والفطر. تحضير الشريحة الهيموسيتومترية: نظف الشريحة والغطاء: تأكد من أن الشريحة الهيموسيتومترية وغطاءها نظيفان وجافان وخاليان من الغبار أو الأوساخ. استخدم مناديل العدسة إذا لزم الأمر. ضع غطاء الشريحة: ضع غطاء الشريحة بعناية فوق منطقة العد في الشريحة الهيموسيتومترية. يجب أن يلتصق الغطاء بالشريحة عن طريق التوتر السطحي، مما يخلق فراغاً دقيقاً بين الغطاء والشريحة. قد ترى حلقات نيوتن (Newton's rings) وهي أنماط تداخل ملونة، وهذا دليل على أن الغطاء موضوع بشكل صحيح. ملء الشريحة بالعينة: اسحب العينة: باستخدام ماصة أو محقنة دقيقة، اسحب كمية صغيرة من عينة الجراثيم الفطرية المحضرة. املأ منطقة العد: ضع طرف الماصة أو المحقنة عند حافة غطاء الشريحة ومنطقة العد. املأ منطقة العد ببطء عن طريق الخاصية الشعرية. يجب أن يمتلئ الفراغ بين الغطاء والشريحة تماماً بالعينة بدون فقاعات هوائية أو فيضان. إذا حدث فيضان، نظف الشريحة وجرب مرة أخرى. العد تحت المجهر: ضع الشريحة على منصة المجهر: ضع الشريحة الهيموسيتومترية على منصة المجهر وثبتها. التركيز: ابدأ باستخدام العدسة الشيئية ذات التكبير المنخفض (10x) للعثور على شبكة العد في الهيموسيتومتر وتركيز الصورة. ثم انتقل إلى العدسة الشيئية ذات التكبير الأعلى (عادة 40x) للعد الفعلي للجراثيم. تحديد منطقة العد: شبكة العد في الهيموسيتومتر مقسمة إلى مربعات مختلفة الأحجام. لعد الجراثيم الفطرية، عادةً ما يتم استخدام المربعات الكبيرة الموجودة في الزوايا الأربعة والمركز للمربع الرئيسي المركزي الكبير. في بعض الأحيان، قد يتم استخدام المربعات الأصغر داخل المربع المركزي الكبير إذا كانت الجراثيم كثيرة جداً. قواعد العد: لضمان الدقة والتجنب العد المزدوج للجراثيم، اتبع قواعد العد القياسية: عد الجراثيم داخل المربع: عد كل الجراثيم التي تقع داخل حدود المربع المحدد. قاعدة الخطوط الحدودية: عد الجراثيم التي تلامس الخطين العلوي والأيسر للمربع، ولكن لا تعد الجراثيم التي تلامس الخطين السفلي والأيمن. هذا يمنع عد نفس الجرثومة في مربعين متجاورين. عد في عدة مربعات: للحصول على تقدير دقيق، عد الجراثيم في عدة مربعات (على الأقل 4 مربعات كبيرة في الزوايا والمربع المركزي الكبير). كلما زاد عدد المربعات التي تعدها، زادت دقة النتائج. سجل الأعداد: سجل عدد الجراثيم التي تم عدها في كل مربع باستخدام العداد اليدوي أو عن طريق كتابتها على ورقة. حساب تركيز الجراثيم: حساب متوسط العدد: احسب متوسط عدد الجراثيم في المربعات التي تم عدها. حجم المربع الواحد: اعرف حجم المربع الواحد الذي استخدمته للعد. في شريحة Neubauer improved، حجم المربع الكبير (المستخدم عادة للعد) هو 0.1 ميكروليتر (µL) أو 10^-4 ملليلتر (mL). هذا الحجم مشتق من أبعاد المربع (1 مم × 1 مم) وعمق غرفة العد (0.1 مم). معادلة حساب التركيز: يتم حساب تركيز الجراثيم الفطرية باستخدام المعادلة التالية: تركيز الجراثيم (جرثومة/ملليلتر) = (متوسط عدد الجراثيم في المربع) × (معامل التخفيف) × (عامل التحويل الحجمي) متوسط عدد الجراثيم في المربع: هو المتوسط الذي حسبته في الخطوة السابقة. معامل التخفيف: إذا قمت بتخفيف العينة، قم بضرب النتيجة في معامل التخفيف المستخدم. إذا لم يتم التخفيف، فإن معامل التخفيف هو 1. عامل التحويل الحجمي: لأن حجم المربع الواحد هو 0.1 ميكروليتر (10^-4 ملليلتر)، فإن عامل التحويل الحجمي هو 10⁴ (أو 10,000) لتحويل التركيز إلى جراثيم لكل ملليلتر. هذا يعني أنك تضرب متوسط العدد في 10,000 للحصول على التركيز في جراثيم/ملليلتر. تبسيط المعادلة: يمكن تبسيط المعادلة إلى: تركيز الجراثيم (جرثومة/ملليلتر) = (متوسط عدد الجراثيم في المربع) × (معامل التخفيف) × 10,000 مثال 1 لنفترض أنك قمت بعد الجراثيم الفطرية في 5 مربعات كبيرة في شريحة Neubauer improved وحصلت على الأعداد التالية: المربع 1: 55 جرثومة المربع 2: 62 جرثومة المربع 3: 58 جرثومة المربع 4: 60 جرثومة المربع 5: 53 جرثومة وقمت بتخفيف العينة 1:10 (معامل التخفيف = 10). الحساب: متوسط عدد الجراثيم في المربع: (55 + 62 + 58 + 60 + 53) / 5 = 288 / 5 = 57.6 جرثومة/مربع تركيز الجراثيم (جرثومة/ملليلتر): (57.6 جرثومة/مربع) × (معامل التخفيف = 10) × (10,000) = 5,760,000 جرثومة/ملليلتر (أو 5.76 × 10⁶ جرثومة/ملليلتر) مثال حسابي مثال 2 (بدون تخفيف): تم عد الجراثيم في 5 مربعات كبيرة، وكانت القيم كالتالي: 120، 130، 125، 140، 135 مجموع الجراثيم: N=120+130+125+140+135=650N = 120 + 130 + 125 + 140 + 135 = 650N=120+130+125+140+135=650 عدد المربعات: M=5M = 5M=5 لا يوجد تخفيف، لذا D=1D = 1D=1. C=650×1×1045C = \frac{650 \times 1 \times 10^4}{5}​ C=65000005=1.3×106 جرثومة/مل مثال 3 (مع تخفيف 1:10): تم عد الجراثيم في 5 مربعات كبيرة، وكانت القيم كالتالي: 60، 55، 65، 70، 50 مجموع الجراثيم: N=60+55+65+70+50=300N = 60 + 55 + 65 + 70 + 50 = 300N=60+55+65+70+50=300 عدد المربعات: M=5M = 5M=5 التخفيف المستخدم D=10D = 10D=10. C=300×10×1045C = \frac{300 \times 10 \times 10^4}{5}​ C=30000005=6×105 جرثومة/مل ملاحظات هامة لضمان دقة العد التجانس: الحفاظ على تجانس العينة مهم جداً. رج العينة برفق قبل كل مرة تسحب منها جزءاً للعد. التخفيف المناسب: إذا كانت العينة مركزة جداً، قم بتخفيفها بشكل مناسب بحيث يكون عدد الجراثيم في المربعات قابلاً للعد بدقة. التخفيف المفرط قد يؤدي إلى أخطاء إذا كان عدد الجراثيم قليلاً جداً في المربعات. قواعد العد: الالتزام بقواعد العد (الخطوط الحدودية) بشكل صارم يمنع العد المزدوج ويحسن الدقة. عدد المربعات: عد في عدد كاف من المربعات لتقليل الخطأ الإحصائي. كلما زاد عدد المربعات التي تعدها، زادت دقة التقدير. التكرار: قم بإجراء العد مرتين أو ثلاث مرات على الأقل للعينة نفسها وأخذ متوسط النتائج لزيادة الموثوقية. تنظيف الشريحة: تأكد من نظافة الشريحة والغطاء قبل وبعد كل استخدام لمنع التلوث وتراكم البقايا. تجنب الفقاعات الهوائية: تجنب وجود فقاعات هوائية في منطقة العد لأنها تعيق الرؤية وتؤثر على حجم العينة. بدائل لطريقة العد بالهيموسيتومتر (للمعلومات العامة) بالإضافة إلى الهيموسيتومتر، هناك طرق أخرى لعد الجراثيم الفطرية، مثل: طريقة العد الصفيحي (Plate count): تعتمد على تخفيف العينة وزراعتها على أطباق أجار ثم عد المستعمرات النامية. هذه الطريقة تعطي تقديرًا للخلايا الحية فقط (وحدات تكوين المستعمرة CFU)، ولكنها تستغرق وقتاً أطول. عدادات الخلايا الآلية (Automated cell counters): تستخدم تقنيات مثل مقاومة كولتر أو قياس التدفق الخلوي لعد الخلايا والجراثيم بسرعة ودقة عالية. ولكنها تتطلب أجهزة متخصصة وقد تكون مكلفة. قياس التعكر (Turbidimetry/Spectrophotometry): تقدير الكتلة الحيوية بناءً على قياس التعكر أو الامتصاصية عند طول موجي معين. هذه الطريقة سريعة ولكنها أقل دقة من العد المباشر ولا تميز بين الخلايا الحية والميتة. خلاصة طريقة عد الجراثيم الفطرية باستخدام الهيموسيتومتر هي طريقة يدوية سريعة واقتصادية ومتاحة في معظم المختبرات. باتباع الخطوات والقواعد المذكورة، يمكن الحصول على تقديرات دقيقة لتركيز الجراثيم الفطرية، مما يجعلها أداة قيمة في البحوث والدراسات المتعلقة بالفطريات.